ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ тема диссертации по экономике, полный текст автореферата

Ученая степень
кандидата биологических наук
Автор
Каролис, Гедиминас Каролис
Место защиты
Вильнюс
Год
1975
Шифр ВАК РФ
08.00.13
Диссертации нет :(

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ"

■--У;'-- ■ ' - ;'■ НапрЭВаХрЗВОПИС»

:: ¿ИЛЬНЮСШИ ОРДЕНА нового.КРАСНСО ЗНАМЕНИ • •.-. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ иы; В.ГЛПСУКАСА ;

-Дарение *-Г а диыи нас Кародио

5 двк высших'-растешй:

03.00.13 - Генетике ; ^; \

диосвртацам на' соискание - зченой с тенен* кввдидата бнояогичесхмх.авзЕ

Вижьнвс--1975

НШДЮСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ШАИЕПЛ ГОСУДЯРСтШШЙ УНИВЕРСИТЕТ ии« В.ШСУКАСА

На правах рукописи

ЦИЕШНИС Каршшс-Гвдииинас Харолао

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕН Б ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03«00.15 - Генвшва

Авторвфв р а I дмссвртвцм на ооигквнив ученой степени кандидата биологических наув

; -.„луаакл^., ^„ум.п;! йккш'Леь. 5 Иввиовс:^.; г, д. ,

лкад;::::.! ..... л. 'и^шмсиа'

Ви/ыют - 1975

Работа виполвова я Лаборатории молекулярной беодогив в генетики ВАСШЛ, г.ыос:;ва (заь.лаб.Есщд.бжл.наук В.Н.СОЙФЕР, научная консультант - академик ВАСХВИЛ и АН БССР Н.В.ТУРБИН).

Диссертация ваоисава ва русском языке* взлелона ва 133 -странице- г*атяяоггского текста, вклечоя таблиц я 30 рисунков. Ь сшсгб литературы 246 ввзвавиА*

Научшв руководители: кзнд.биол.заух В.Н."0ййЕР " канд.бисл.ваук И.1>*СЛАВБ11АС

Офнцисльнр* оппоненты: Лектор медицинских наук, профессор Д.Ц.ГОДЬДФАРБ (Косква) "кандидат биологических, нгув, доцем 8.РАНЧЯЛИС (Вильвюо).

Веду ада предприятие - кафедра генетики к селекции Биологического факультета Московского государственного университете им. ILB.Ломоносова.

Автореферат разозлен * Л3 " 1975 г.

Защита диссертации состоится j975 ri

в _ ч. во,засодьнии Ученого Совета Естестваяного факультета по биологическим наукам Вильнюсского Ордена Трудового u Краевого Знамени Государственного Университета нм.В.Квпсуяв-са (Литовская ССР, г^Вилънюс, з*.Чвргенко, 21/2?! I геологическая ауд.).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотек« Вжяъпюсского Государственного Университета (г.Внльнво, ус. Университете» á)i

и

Замечания и отзывы во автореферату просим направить.ло адресу: 2S203I, г.Вильнюс» улЛврлеиио, 21/2^, Секретарю^ Ученого Совета Естественного факультета во биологическим наукам БГУ.

, * ■ ♦

Ученый Секретарь Совета: доц. Я.Груодева

ВВЕДЕНИЕ

Изучение проблемы ре пародии генеических повреждений i клене имеет первое те правое значение для выяснения молекулярных механизмов действия систем, определявизх направление s темпы кутзгеиеэа, поддерживающих стабильность генома и, следовательно* устойчивость организмов к различным неолэгопраят-нш! факторам внешней среды.

У прокариотов было открыто 2 основных типа репэрЕции: фотореактивация (к«ь«г, 1949; Ковалев, 1Э49), тетювая репарация« 1.клпчав49ч экыщзиовнуъ репарацию ( noyco , nowerd-

Plonder» , 1964; Sotlow , Carrier, 1S64 J ц ПОСТрвГЛИКвТИВ-

HJK репар^циг; ( Rupp Howar<-Flanu«re , 19бв ). КрОМв ТОГО,

ивъэстно, что ферменты темповой репарации прямо или опосредовано участвуют г процессе возникновения мутацлй ( witkin , 1968; СОИфЧ?* 1969), В процессе рекомбинации (Howard-Fland«r», 1968) н в контроле репликации ДНК.

З.Харм, Р.Троско, Э.Чу показали, что возникающие под действием солвечасго света дииеры гаимна эффектив„о усураня-вт^я репарационный» ферментами в клетках бактерий и человека

( Harm,1969, 1970; Troftko, 1970t Chu et i 1970 Не С 0110« E-

Bo, что и растения, постоянно находящиеся пот воздействием ультрафиолетового облучения* должны обладать зиеммой ре парирующих ферментов. Обнаружение у растений свойстве фотореактив

В8ЦКИ (Troako, Mansour, 1969¡ Salto, ./агЫл, 1969 ) П0Э1Ш1В

увидеть один из ппс® репетирующих ферментов* Д.угс1 тип репарация у рьотений Jux недавно обнаружен Хоулаидом ( how-

land «t AU, 1974, T97L ), К0ГД8 ОН П0К 1ЭаИ репарРЦНЮ pE3pdBQB

ДНК* вызванных у -лучами. Но фотореактивация - узко специе-яиаирогаияая системе репарации. С помощью фотореавтивациж происходит восстановление гглъко одного вида повреждения -димеров цивхобумногого типа. Другие типы повреждений (например* многообразные повреждения* индуцированные химичевжя-ми мутагенами) могут бить репарироганы системой ферментов темновой репарации*

- * -

t Исходя из этого, представляло интерес изучить вопрос о

существовании тэнновой реперации у растений. Хотя нервы« попытка обнаружить теивовую рвш рацию в высших растениях окончились неудачно (тго&ко, Menaour, 1968t Wollt, Scott, 1969) Paln&r , Wolff, 1973;' Wolff , C]»sv,r, 1973 )» CJfflOCIBJDT ГрЯ

гриппы даннйх, свидетельствующих о впстэновятельвнх прсцео-свх, в -эгакно близких к энсодзнойной репарации. I. Эффект уменьшения аберра.пй и щгэций, вызванвых отдельно УФ- ш рентгеновыми лучами, а такзе пря совместной действии этих

фаВТОрОВ ( Sw ал б ОП,- 1948} Swamiriathan , JJatarejaii , 1939) Dan aal et Vi., 19t,^i Nlrula , 1963; Robbe lern , 196« ). ¿. УВвЛИ-

чевцв выходе хромосомных в хрокзтндиых аберраций в условиях обработки кофейной Облученных растений ( Yaroamolo, Yamaguchl, 1969) Ahnetröm , Natarajan , 19,71;. SwutHn»ka, 2uk, 1974 )•

3. Способное и. растений восстанавниват. веко»очно повреждения, вызванные а«нилируощиш1 агентами (v«i*min«ky «t 19721

1973g Glchnar «•< ei.« 1973; ZedraiU at at„ 1973).

С цельь пряного доказательства существования »многой репарации в высиих растениях мы исследовали khuqibsj воэгяк-я ob вняв дилеров ткиина в ДНЕ растение in vitro л in vivo и выцепленке динаров иа ДНЕ проростков чины (ычну™» »ativa Ii.- ), подвертя}ти* 7Ф~облзчошнй'

Списог сокращений

УФ - ультрафиолетовые кучи

КНРФ - кнсхотонерасхворикея фракция •

KP« - кислоторастворимая фракция

ЭДТА - этнлендиаминтетрауксусная кислота *

SSC - буферный раствор (0,19 II Naci, 0,015 II цитрат иатдея) TU - трииорп(яс?сиав кислота.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I, Включение радиоактивного тиьидина в проростки ва ранних стадиях ра згч тая

Включение Н- и С^-тииидина и распределенного пророс/Ну исследовали на проростквд Citn-.Hu» всШИв Ь. , БЦраЩИ-вавюихсг б течение 5 суток я теннотэ и за^и пере не санных в специально изготовленные микросоеды с годным раствором ти-шдинэ. В нужнее время отбирэ.-л проростки, оазрезели их ва сегменты* гомогенизировали в гомогенизаторе Уоринга в 10$ ХХУ на холоду, выделяли стандартным методе:! КНРй и КРФ и определяли иг радиоактивность. Использовали йэ-«втил- и тимидин (20-40 шскэрч/цл, отачест.прэпарат).

В проростках, развивающихся в растворе Н^-пш* чииа 4,5; 5,5 и 6,5 суток, количество метки в отдельных частях пр-ростка изменяется закономерно по его длине: в корне при удалении от апикальной части проростка количество метни увеличивается, а в стеоле уменьшается. Эти данные справедливы как для кисяотпаерастзорииои, так и для кислоторастзоримой фракций. Увеличение удельной массы отдельных частей проростков хорошо коррелирует с увеличенной доли Н3~тишда та* включенного в .состав ДНК как в корнях, так и в стеблях п^орос"-ков. 91% метки КПРФ всего проростка приходится на долю корешка.

Прл повышении концентрации тимидика удалось под пси ть удельную активность ДНК рэститерьньк образцов, однако соотношение радиоактивности в форме Н3-тишцгкэ в ШФи КРФ осталась иеяцманныг: по длине всего пророотка. Для обеих концентров было о печено, что окоп 20^5 радиоактивного тимн-диаа, поглощенного ироросткаии, бпо сдсредото^ено в лНРФ, прцчем в керне 30$ метки Сило включено в КН?Ф,.а в ывбл« не эту фракцию пг ^о^игхь только около 10^ метки.

2; Получение высококеченвЖ растений

Ила полу .|«чв_, в достаточное стелой:: мечеиой ДНК растений использовали семема <щны иосевЕ I мпугив «^а ь.). Семена скарифицир^^л^, заначивали в во;.э I ио в стер и ль-

■. •• 6 -

г. их условиях, отдегзли ."вро^ыш и ломевдали в чешках Па три в соад Уайта с цобавкаии пеницьягчна, вдеи^зина и Н3-аетил или 2С1^-тищд,;аа. Из четырах-Пятидневные проростков» гомогенизировавши в видком азоте, *ыдепяли ДНК по cxeufi fiapiiypa (wir-mur , 19614 ) с лримвнгниен буфера измененного состава и дополотого эй проыеку точной депротеичи^пвв пронвзой (ЮО ыг/кл). По спектрам поглощения контролировала чистоту препаратов. Определяли количество выделенной дНК, изнуряли ее радиоактивность а подсчитывали индекс ыечания ДНЕ (рвсп/мян на ккг ДНК). в которой определяли количество димеров (А/т вьпляли в темноте. ДПК из КНРФ выделяли по Спирину ■ Велоэерскьау (1959).

' }ровни ьхлючения радисзктивного тимг.дина в ДНК растений -сэ могли удовлетворить нас в плзве мзучеюш киввмка димвриэа-кии растительной ДНК. Дело в той, что мшары тикша, как правило« образуются в других изученных организмах в количестве 0,5 - от всего содержания ^лмкиа» Для получения достоверных дагп 'пс при хроматогря^ичеснои равделетш гидроллззтов ДНК радиоактивность, приходящаяся на димерную область, должна составлять около ста иилупьсов в иицуту*. Следовательно, суммарно ' радиоактивность образцов гидролиаятов ДНК, наносимых на хрома-тогремму, должна, был*. составлять ылнимт ческолько десятков тысяч импульсов в кинуту. Для этого nj*.ne было получить растительную ДНК с удельной активность» насколько сот распадов/шш на 1 шг\

Гвэультатн предыдущих опытов показал», что для получения высокомеченой ДНК растений при переносе, материала s радиоактивную среду можно не докидаться, когда зародыши начнут рост, а сразу помещать отделенные от семядолей зародыши в раствЬры « меткой* Это давал» возможность, во-первых, добиться того^ чтобы помещенные в радиоактивную среду ненабухшие эародчищ васасывааи метку сраву с начала набухания, во-вторых, удаление семядолей устраняло засасывание метки se в эмОрионзльвке ткани корней, а в первые семя дольше листья к повволияо метить зародыши в минимальных объемах среды, что в несколько раз уменьшило количество используемых радиоактивных препаратов, в-трет^их, с сеыядолякк возможно удалялась часть пула

*

свободного тимидина. Использование среда Уайта, предназначенной для культуры ткана й, с добавка ид еденозииа увеличило уровень включения метки и позволило получить ДНК с удельно? активность» 900-2500 ^асп/мин.мкг 2IHKV причем в корне она быда г 3 раза вше, чей в стебле*

si Изучение систем хрома тогрз^м радиоактивных: тииияовш: д- меров в связи со спецификой их обнаружения г растительной ДНК

Искусственные тишговие динары получала ив 2С**-тимиди-fi и тнгодва по ръкжерсу и Гэрг-дсу ( зеииега ,. uerends , íst-s). Дилеры гидролисовали в 85% муравьиной кислоте, очияэли гт принесен тимина, спектрофотометрачески определяли (SP-8000) чистоту препарата, спектры поглощения в коэффициенты подвижное ги из бумажных хроиетогрв'шах г> пяти системах растворителе Ч. чепользоваш следующие системы растворителей: для одномерной хроматографии: (I) бутано.*! - уксусная кислота - вода (80:12:30), (П) бутаиол -вода (80:14), (I) насыщенный сульфат аммония - IU ацетат натрия - изопропанол (W:?:I) (растворители пропускали .дан, два или три pasa)* Для ги.унврной хроматографии: "[ГУ) I растворитель в первом, Ш - •чо втором вытравлении, (У) П растворитель с первом, Ш во втором направление. В первом направлении растворитель пропускали ¿-3 раза, во втором - I—ü раоо. иону диыеров определяли по свидетелям. В качеств, свидетелей использовали искусственно пригиховленные 2С^ч*тишшОБые д»иеры в ч основ&.шя. Pactio-аоа.ени" пятен опре *,еяяли nv aor:i оценив при 260 ни. Для яод- , счёта радиоактивности димерную и тиминоьне зови разрезали не св^мент^ размеров 1x2 cu (для чдаоыерых хроиатограмм) н Ixl cu (для даумернчх xvouatorpauu). Элщав материала -ims л I La воды. Элюат заливали диоксавовт! сщштнллятооом и подсчитывали радиоактивность. Днмеры в ЕРФ определяли хроцато-графией на колонке со смолой Doi.ex íxs по методу Севигучи И соавторов (sakiguchi ot'el., 1970 ) с использовэанеи кол-ве к тора $рак:дЬ - увикордом ( ькв Ц.офильгроваиную черев нитроцоплплоаные фил:.тр^ КРФ обессялввали я освобождала от свободного радиоактивного тихидива фильтрованием черев ysi-

траиви£(рв«1| |Ла';о им-оз (лтк ро ), В 8ГМ0Сферв ВЗОТв При • давлении 45 дси не установке г-,м-20? (аонсоп ), хроматогра-фировала на.широкой Румааной хроматоггамме с последующей алюпяей димврной зоны водой и повториш анализом на одномерной хроматографе в И растворителе.

Первые моде ль "не хроиатограммы ичрояизэтов облученной меченой ДНК указали на трудности р .еденная тшашових диме-ров* Ыа одномерных н двуиьрных хрокзтогрэтжвх у точки старта и в блаалежащй области накапливались неидеитифицировевньк радяоактавные проекты., которые не позволяли достоверно о.п-ре^лить количество динаров. Освободиться от этих примесей удалось, протекая растворитель несколько ^аэ, Часть приме-'сей оставалось в зоне с ш о-од , часть уходила вниз с фронтом растворителя. В связи с этим мы проделал» модельные опыты с искусстве ниши дамбрами ткшшь, чтобы определить коэффициенты подвижности после вэедого пропускания для одномерных и двумерных хронатограмы, так как в гитературе таквг данные отсутствовали (таби.1).

Таблица I.

Коэффициенты хроиатогрэ фяче ск от о разделения к! , димепоэ тииина*

растворитель Коэффициенты

однократное пропускание двухкратное пропускан"« трехкратное \ пропускание ,

1 I 0,24 0,44 , 0,56 |

! П 0,1« 0,25 ' 0,34 I

, Ш 0,63 0,?Э 0,Е£ '

* Бумага Ватиад К» I (whatmen , Анпшя). u

* ■

Использовать I растворитель невозможно из-за плохого разделения динаров тимина к цитозинэ. Даже ¿ри незначительной передаче' радиоактивности цитоэину. возможны артефакты. Это ис-клгпшет П растворитель (рис.1). На двумерных хрокатограинах горошего разделение димеров удолось( достичь, применяя У систему (рне.2).

_ 9 ш

Без предварительной очистки КРФ из меченых проростков точно определи» количество не удается. На колонка

со сколов ьствхгхе этому препятствуют неидентифицированные принеся, сходящие с колонки перед динерайи, на бумажных хроаатограимах свободный пул радиоактивного шин дива и соли Для преодоления этях трудностей бы* разработан процесс пред

о Г

'»'Ч С£> ср ■ О СП ||

Рже Л. Положение димеров 2С1 -тииива и 2С-1-тиыина на ра-диохроцатограше после оду о-, двух- и трехкртного пропускания растворителя по сравнения с полок-ниек

четырех оснований (П растворитель} а - гуанин, С- цитоаин, А - адьила, I- тимии. Границы пятен обозначены юнтураш. В верхней'части рисунка указано распределение радиоактивности на радиохрома тогра«ме дилера ишяа я гииилв (второй ш-к).

............ т^с творив ль проиунен 1 раа

— - - - - растворитель пэопуцеа 2 ра»а

»—----— растворител_ про.^ущен й раза

В кинеГ *;аст„ рлсувка украано положение ©снований на хроматограмиах, выявленное улмгахв1шскишм; Кг I - одчокрйтяое 7ропусяаши, Ч Z - дьувратво« 16 В - трегаоатноа '

Рис. 2; Часть двумерной хрома тог рэшы динаров 2С^-тимина, кедашвризован.чого 2С*^-тишна в четырех оснований при двукратное разгонке в обоих направлениях в У.зи-стаме раотгорителей. Распределение радиоактивности указано для дшзрной-области в правом верхнем углу, для тимнна в нижнеи Чести хроматограммы.Ковтуры пя-- тен оснований-гияваенвые с помово>ы ультрахемископа, указаны пунктиром для случав .разгонки в первом па-правлении, слпмшоя влиаявй - после разгонки во втором направлении. По вертикали и горизонтали указаны воэф-' фициепты . Размеры целого тшста 50x27 сМ.*

- II -

верительной очистки КРФ. Нейтрализованнуп КРФ, профильтровал' ную через нитроцелшолозный фильтр HAwp оогзоо (с диаиетрок пор 0,45у*. ), дополнительно5 профильтровали через улитраивм-брани 'о1апо им-05 (аш1соп , С.Ш.А.). Это иеибраны аадчраивают все растворенные вещества, иолек^кярннй вес которых вше 5и0. Таким образом достигали двух целей: ^бессолн вали раствор и на 4/3 Ъсвобсждздк его от свободного тинидина кислотный гидролизат проверяли на хронатогранме во П растго-рителе1. Проверка пиказала, что в нем присутствует только ти-шдин. Подготовленную растворимая дрэкцию, <:к онце н трир ов зн-нуи до минимального обмена, выпаривали досуха, гидролиз овал в У55& муравьиноЧ кислоте и наносили "пшрог.ш стартом" - полоской (10x0,5 см) на лист хроматографической бумаги (50x27 см) на расстоянии 7 с» от верхнего края листа. По правому крап износили свидетель (искусственные дичеры такт-з и цито-

зич). Растворите,л пропускали 3 раза. Путем подсчета радиоактивности в зоне пропуск а е.; я свидетеля ояредегчпи дииернув зону. Из полученной хроматограшы вырезали дкмерную зону и разгоняли в иердвндоыуляряос направленна в воде месколько рвг (обычно до 8), Пюле-этого элюировали материал водой (в течение ночи - 2-5 ыл раствора). Полученный элюат выпаривали над водяной баней до минимального объема, смешивали с муравьиной кислотой и,наносили на полоску хроматографической бумаги (48x2 см) для повторной хроматографии во П растворителе с однократной разгонкой. На повторных хронаготргимах присутствовали лишь-радиоактивные пики тииновьи дииеров,возводя вие точно по; .зчитать ко диче сю димеров^

4. Изуэчие ьинетики У0-динвр"Зации пи^-хмиди новых ос..овьяиа 3 р^стительь^й ДНК

~ля количественной огчнки влияния УФ-облучения на ДНК растений до изучили кинетику Уф-димервзации ял£>инндиноь в ДНК Удельная радиоактивность ДШ,, использованной в этих опытах, была равна £60 расп/ш"в на мкг ДНК (Н3-нетия-тиии-даи, отечестинний препарат). Под действием У^-обиуч^яки • было обпзружеио воэаь.шовеяиь диме|">в танине и снепаньых № мерог танина и цитозяка (табл.2)£

Таблица 2.

УФ-длмеризеция пирим>.динов ДНК ^ины

1« Радиоактивность в г.имерной области Сишт/нин)** - Радио- ! $t/X ¡

■ Димеоы fy димеьы й; ность в тт/т

¡s¡ к ps Общая фон Чисто ди-líjp-ная Осщая Фон Чисто ди-мерная тимино-504 облаг ти (имп/ шн) &) (%) «

t 0 42 10 . 32 . S3 . 28 5 1?9779 0,025 0,004 |

¡0,5 159 7 15? 99 17 $2 I0663I 0,143 0,077 '

I 270 98 232 71 16 55 78382 0,296 0,070 !

1 3 228 5 223 S6 0 36 30686 0,727 0,Ш ,

l 5 731 II 720 123 5 118 57946 1,21(3 0,204 t

1 & l 1154 16 1138 III 7 104 878W 1,296 0,118 i 1

s - лампа БУФ-15, расстояние 18 см» ДНЧ в 0,Iï s se. 250 мкг/ыл. »- Одномерная хроматеграмма, П растворитель, 3 раза,

Димеров ЦТ типа возникало в несколько раз маь^ше, чем ликеров типа ТТ, Кинетика возникновения обоих тиков дилеров подчиняема одноударной зависимости (рис*3а>. Максимальное число ГЭмеризуемых тиминовых остатков у чиЪы приближается к

5. Изучение кинетики дкмаризации хинина в ДНК растительных клети In vivo

.Для о (Нарушения вырезания димэров из ДНК Уф-обдученных проростков надо было выбрать биологически оправданную дозу облучаьия. Для такого выбора недостаточно данных по кинетире УФ—ДИмери88ЦВГ i.i Vitro , потому что в клетках монет происходить рассеивание " ' . части падающего на них коротковолнового света и поглощение части УФ-дучей пигментаы и клеткеаи эпидермиса. В связи с этим была научена кинетика Уф-димериэр-ции тимивовых остатков в .ДНК " vivo * (рис.36).

m vivo - уровень диыеризации ■ лиримидиновых оснований примерное 2 раза меньше уровня* который наблюдается in vitra. Мак'каальное число димермэуемых ти айнов пв данном случае с оста-

- 13 -

Для вечевия зародыпей использовали 2С**-тииидин (50 мккюри/ыл, отечественный препарат).

.гут

X ft3

f2J i s е т v

Лом pfruf4ti#isAH и. I

а)

fO Í0 JO 40

Д.О! ■' oÍAyWtHU*, Mil«

S)

Рис.5'.-Жине гика Уо-дииеризвциа та мина б ДНК » - ¡n vitrt-( ск. стр. 12).

О • fn vivo:

■4-дневные проростки о<* печали 3-1Ш дампа ки БУФ-15 с расстояния 10 си. Сразу посла облучения пророста замораживали жидки:, эзотои и выделяли ДНК. Количэ-ь ство диыерм в кислотных гидролиэатах ДН2 подсчитано на одномерной хроматограмме (Q растворитель, З-крзтная разгонка).

6. Выщепленив димвроч тимиаа из ДНК облученных проростков

Посла из7чания кинетики УС^-диквризация гиынна мы выбрали дозу облучения, при которой образуется около 0,15?» .дишров, т.?, такое минимальное количество^ которое исключало бы количественные ошибки при низком уровне вырезания

димеров иа ДНК и в то же1 время'обеспечивало бы достоверное олреде-.еясе оставшихся дилеров при высоких уровнях вырезания. Еародаа^ метили Н3-ы9тп-тииидинйм (60-80 мнкюри/иа, отечественный препарат). При инк;;бации Уф-облученных проростков в теплоте в среде Уайта без Н3-тиыадина происходило вырезание димеров ткшна из ДНК (табл.З),

Таблица S.

УФ-дкнериьация тимина в ДНК проростков чины и вырезание димеров из ДНК во время инкубации в темноте

Бремя инкjбашни Я*'С л в сЗдуччиия,

чась?

Ра ди ой к г: is н о с ть**,

дкшв риал область

тиии новая осласть

Число дкмаоов в ДНК Доля ' вырезан-1 них ИЗ f Ш да- | мзров,

.0,014 0 1

0,007 0 \

о,оп 0 1

0,123 0 '

0,043 65 '

0,037 70 ,

0,081 I

0,061 50 1

0,071 43 '

Контроль (баз оолученЕ.))

То же . О

• ' 2 б 12 28 46

S3

24 20 246 92 65 458 ZW 215

266520

322999 173993 19У468 212097 №47' 566199

S0552I

* 2 лищщ БУФ-15, расстояние 20 см.

й одномерная хроматографа (П вастеоритс ль, 3-х кратное пропускание).

Основывась на яолуетшх данных, в последующих эксш.-риментах '.ш изучала процесс выреиния тиминовых димеров только до б-г о часа инкубирования в темноте.' В гччестве ра-дноактиг юй метки >> это« сорви опытов „спользовали ¿С^^-тчца-дин (26-30 MKKwp^/ыл, удельная радиоактивность чв шсюри/uM, <n»pua eis \ фраыдая)', а анализ вырезание проводили с помощью одномерной (П растворитель, * раза) и двумерной (У си-стека) хромо тог рефш п булвгв (табл.4).

Полученные в этой сэрии опытов данные подтвердили вывод

<■ * ■ Таблица А.

Вырезание динаров гвшнэ из ДНК проростков чины в те киоте и исчезновение динаров тиминз нз

свету

1 № ЮТшга \ I 1. 3 Длительность инкубирования в темноте * Контроль (без обличения) Вид6 1 хроматографии Одшжерия. Двдгериэя Радиоактивность иип/нин Содержа- 1 Доля ди-вие ди- |мйров, Среднее 1 по < всем I опыта и |

^•.эраэа облзегь 14 10 тиминовая область 1Ьц25 127802 «еров (ТТ/Т), % 0,011 " 0,008 ВЦрОЗЭН-ных иэ ЛИС, %

1 I 1 2 1 3 , 4 Без инкубации (сразу после облучения) Одаомаргэя 0 Двумерная >< 852 258 825 34 567330 252700 444972 £8016 0,150 о,ш 0, *85 0,247 -

1 I 1 3 1.ЧЭС в тошюте Одномернал ^■у корная 845 70'; 548У20 Ь85795 и, 154 0,182. 0 1,6 0,3 1

| I 1 2 1 3 4 часа в темноте Одномерная я Дв^ерпся 532 13? 755 тт '167 ПО 472814 0,126 0,036 с, 160 16,0 22,6 1й.5 1

< I 1 2 ! 3 1 4 6 чзс. г теаноха Сдноиерная в Двуиернзя и 580 124 496 86 492290 155820 Ь93387 24991 0,118 0,091 0,125 .0,1« 2")0 18,1 32,4 41.7 28,4 '

» I 1 2 6 час. в^ свету Одномерная Двумерна^ 62 63 98559 38323 0,063 " 0,164 "3,3 33,6 Си,5

- 16 -

« существовании явления вырезания дииеров тимина из ДНК ия-тактаыж проростков чины, подвергнутых ультрафиолетовому облучению. иллоть до 6-го чг за инкубирования сохраняется одно-ударная кинетика выреэчния,димероз (рио.5).

Рис.5. Кинетика выщеплеяяя димеров пшина из ДЫ проростков

■ чину при инкубкрованчи их после Уф-облучения в темнота.

В .(летках проростков чины удается также обнаружить ис-че^новенп дииеров тамина изДЛС при освещении ироросгсов види"ым сватом. Для изучения это,, о :роцееса (по своей природе являющегося, "О-ри^иком;/, фотореактивацией) часть материла пос;.л ультрафиолетового облучения оставляли в течение 6 часов -на свету (одна лшклесцентвав лампа) а затем в этих пророот-ках ачаниаировзли процентное содержание димерсш -гшшна со иа-иду, .»писанному выше. Данн-е этой серии опытов привадааы в табл.4 (две последних строчки). Было устаповлено, что около 40% всех ьоэцлкшр^ 'в ДНК*димеров исчезло (возмгтно, восстановилось в к зоыерное состояние) пуслс освещения чидвмш светом. В^хьо подчеркнуть, ,то иэ свету происходят устрвкетк большее числа лчмеров гинина, чем в теме .те. 0?чэь:о в обоих случаям устранении подвергается менее пох^доны : сех возникших в ДЕК дииеров.танина. Напомшпг, ч^о я в другой исследованной системе клеток высших организмов (клетки млех питавших) отмо-

- 17 -

чеяо .тана:« выадвлление тшь около /юловины (иногда до 70$)

всех ВОЗНИКЛИ* ДИМбрОЦ тииина ( Setjow , Carrier , 1968; Regan et el., i960 ).

Хотя ДНК виделяли стандартно or опыте к опыту (об этом свидетельствовали спектр поглощения), и известно, что степень димериэеции, определенная в выделенной по Шрмуру полимерной ДНК и в КНРФ практически ")дйизновв" у прокариотов ( Maeelt е. al,j 1973 ), Мы Проверили Нв ЗСВИС:Т ЛИ КеОЛЮДЭв-мое уменьшение количества димеров от метода видиления ДНК* На примере jcpc итографичегного анализа кислотны« гядро/лэз- ; тов полимерной ДШ;, с одной стороны, и Д1Г% „ валенной из ■ КНРФ, с другой сторона, было показано уменьпенме количества Ликеров в ДНК проростков, инкубированных после УФ-об лучения в темноте.

7* Ане ли- нэколлевгя змеров в ¡си е ли хоре с ri эриаои '

фракции клеток проростков, инкубироьаннгтс в темноте после Уф-облуче«ия.

Тивиновые димары в предварительно неочищенной КРФ из проростког^ инкубированных в темноте после Уф-облучения, были обнаружены с помочь» двумерна б^кавной хроматография и с помощь® колоночной хрыат аграфии (смола dowm ixe в первом случае количественному определений препятствовало. Соль вое количество гс^-химичииа из свсЗодяого пула» во второй -неидентифищфованные радиоактивные, примеси, сходящие с колонки непосредственно перед дииерныик фракциями Точьо определить количество тиииновшг дямеров удалое» на повторных хрома-тограммах КРФ (в эяюентах дииарньк зон» вырезанных из хрома-тограмм). Данные этих экспериментов представлены в таблице 5*

Дилеры обнаружены также и в контрольных КРФ. Разница между количеством динаров в опыте и в контроле практически равна тому количеству дииергв,. которое в соответствии с Si вырезания вырезания определен для полимерной ДНК и КНР? предполагалось обнаружить в КРФ пр оив ку Си р ованн ьо. проростков. Присутствие димерсв тимина в КРФ иеинкуби^ованных проростков Можно обтяснитв вкладом неoneпифических процессов поверхлост-ных тканей, репарацией под луч од или ооразове'нием димеров ив

свободного пуда таиидиаа.

Таблица 5»

Распределение радио-ктивнисти в равных фракциях

проростков

I

I I I I I I

Фракция

1 ДНК из КК.Ф —

Радиоактивность (расп/шн)

Облученные проростки

сеэ инкубации

1023431

КРФ

над уль^эмеыбраной

под ультоанемОаной иыч>5

общая

78885

1404889

148377-'«'

Облучена»« проростки»инкубированные 6 часов в те и но те

1046209

284010

1338519

1622528

, Беев материал

2507204

?.670783

'ТТ в КРФ

5732475

6423180

1 % вырезанных иь ДН" диие-' ров, накопленных в КРФ (______________

0,^28

0,240

8* ИнтиОированлэ оксимочевиной роста проростков " и синтеза ДШ

ДНК цпцащзди в водные растворы оксииочевины. в нужные ' интервалы впей..ни отбирали пробы, определяли длину и вео проростков, Из пчралленьных проб выделяли ДНК я определяли вн-декз печения. Попечение семян чины в О,XII раствор оксииочевины резко понижает их всхслесть, прч воздействии 0,054 раствора отлечается незначительное ингибированиа прорастагчя, более разбавленные растворы практичаски не окааали влияния на вс^о-: I эсть. Развитие проростков,, перенесенных изводив растворы оксимо «евины, ингибирова леюь концентрапчяш - ЮН

(рис.6).\Пов14£внив крнцевтрацгя оксииочевины от 10""3У до 5.10™*М в сред» для роста приводит ж прогрессивному у ценно-

' Рис.б. Влияние оксимочевивы не рост проростков чини.

А - корни, В - стебли*

нив включения 2с1''-тикидине в корни (рис.7) и сильно икгибиру-<„ от синтез ДНК в клр.un* высших растений, росвих в растворах агента. Лишь I5-ü5fS ¿ИХ по сравнении с контролем синтезирует-

S

£2000 ¿■1500

§

^ 1000

I '

§ 500

•n dl

10~*M 1{Г*М

w1»

Контроль

JE

MB

Ряс.7» ¡Заияние оксимочевииы на включение 2С1* тиоддииа в JUK

корне3 чины.

ся в:тих условиях. Совпадение концентраций, вызывающих инги-бироваиио синтез^ ¿НЕС, и кинетики эгого процесса с концентрациям и кинетикой ингибированьи развита" пророотков позволяет сделать вывод, что причин? подзпе^чя роста обусловлена пряным влиянием оксимочечины ня синтез ДЫК.

9. Иг;чание реп-ративного (непланового) синтеза ДНК

3 проросли сра?7 после облучения вводили оксимоч евину я радиоактивный 2С*^-тимидин '$ ыккюри/ыл, удельная :>эдь оакт"в-вость 48 шюри/мМ (* eis. ), вакууминфильтрандей и инкубировали проростки в темноте, пооле чеги выделяли ДКГ* У измеряли индекс мечвЕЯ.

Ериа В nptpOCKÖX _othyr,i» eai.va L. . СущвСТВувТ рвиЛ-рвция- то пдсле облучении п^и инкубировании проростков в тонной г»".ры должны удаляться, а бреш в iUJC застраиваться, Вели репликативный синтез инггоироврть, то, следовательно, :жжочение меченого тимлдиаа в теку» ДНК следует рассыетри-

103г

п

I

EL

i

1 2 J ч

Ряс'» 8* Включение гс^-мкидина в ДНК пророс*кав посла

УФ-облучения.

гс^-тинидиЕ инфильт^мак вакуумом в ¿-суточные прп-Íioctkb. После этого проростки облучены 2-мя лалпаш БУФ-ií, 5,5 ш. с расстояния 20 cu и проинкубированы 18 часов в темноте.

I - контроль, 18 часов после инфильтрации, üC^-тиии-див, без оксимочевинн, не облученные (9бС*Зб расп/миЕ на ыкг ДНК);

* Z - до инфильтрация сутки г овсишлевине

Инфильтрация 2С1^-тииидииа с окснаочевиноИ *-1(Г211, яеоблученные (200*9 расп/мин на шг ДНК)! 8 - то же, после инфильтрации, облучение УФ-светом

(240*11 расп/мин на мкг ДНК); 4 - то же, что ü плюс инфильтрация 5-брондсзскснури-дияа - (122*6'расп/мин ча ккг ДНК),

- 22 -

взть как так называемый нема новый, т.о. ре па ративный синтез,

Нэ рис.8 приведены данные одного из опытов по изучению непланового синтеза. В этих опыте:: отмечено увеличение включения печеного кмидина в ДНК после облучения в присутствии оксииочевины, что мы рассматриваем как н-плзновый синтез.

Известно, что синезеленые водоросли после облучения способны включать ZC^-ТИЫИВ В тшополисахариды ( She»lakov at ai., 1975 ). Чтобы проверить, действительно ли в наших опы-сзх гс^-^кмидин включался после облучения в ДНК,' мы гчдроли-вовали ДНК (с.;оло 50 ukv), гидролизатм проанализировали аэ С/махных хроматограммах. Анализ показал, что радиоактивность протестует только в таил нов ой пике.

в а в о д f

2. Изучена динамика включения и характер распределения Н3-тимйдинз в проростках citrutiue «<*uzu и Не основе этого отработаны условия для получения высокомеченой растительной ГНК. '

• 2. Изучено несколько систем растворителей для бумажной хроматографии радиоакиввнх тишновы.. дииеров и подобран реви;; их хроматографии и очистке в связи с э спецификой обнаружила ¿гомеров пиримиднновых 'снолз.зй в кислотных гндродиватах растительной ДНК.

С. Исследована кинетика Уф-дамеризации пиримндлноэдх оо-лОваниГв растительной ДЛК in vitro л in vivo.

4. Ио^аэани, удаление УФ-индучарованных ти^иновых динаров m ДНК Уф-0ьлученных проростков во время и-кубеции их □ темноте* Ьссдедолаие кинетика вырезания. Количественно сходню вечеавовеь.е дикеоов тимина из ДНК обнаружено пои вцд-ржиэа-нии проростков в течение б часоа в- свету.

Показана, что наряду с уиевиен>.ем количества тжмито-вых дииеров в JtiiK' происходит их накоплени* в хислотораствори-мой фракции/ " "

б. Иаучвио ингибирующие деЗс-вие оксимочевины на рост грориткбв и синив ДиГ, определен диапазон концентраций оксимочевины, вызывающих эи кнгмоврованне. .

- 23 -

Показано увеличение включения £С^-гиыидина в ДНК (возможно отражающее неплановый- синтез) „роро'стков, инкубируемых носке УФ-оолучения в темноте "я уоловпх ш^гибированчя норма льной репликации охсимочевиной.

8» Обсуждается предполоаьлие о том, что вирезаике динаров из ДНК, выход их в КРФ и возможное существование непланового синтеза являотсл результатом терновой репарации эк^.ци знойного типа. 1

i

Материалы диссертации отражены в сведущих ' публикациях; ' i

I. Включение На-гииидина в проростки citruiiu«. »duii» на

рбННИХ стадиях развития. -Lfetuvo» gen*Uk4| ir »elekclninkn г«-•p. :koni. tez¿». к., 1972. р.2-3, Авт.: В.СоПфер, Ю.Ти?ов, | К.Циеминис. - На литзв.яз. '

2* Подавление роста и. развития l^opoctkob чины ингиблтором синтезе ДНК оксимочевиной. - пД&г.з.ВАС2НШГ, 1979, т. 10, с*8-9. Авт.; К.К.Циеминис, В.Н.СоЙфвр,

а, Ингибировагаае оксимочевиной синтеза ДНК ъ клятвах корней проростков чина. - "Довл.АН СССР", 1973, т.213, te б,

с.IX43-I450. ¿вт.: В.Н.Сойфер, К.К.Циеминио, Н.В.Турбин.

4. Выделение полимерной FHK из растений.- u«tuvo* е«1«Ш£ц ir

", ••l*kcinlnkii reap. koní. t*z*». К., 1972, p.l-2. АВТ. Í B.K,COfli£ep,

К.Циеминис, В.Дорохов, Ю.Титов* - На латов.яз.

5. Прямое изучение синтез«. ДНК в проростках ячменя в норме при облучении гемме-луч а ми и при постлучетюй обработке кофейной, "Дока.ВАШШ", 1975, т.И, с .'8-Ю. Авт.; В.Н.С^фер, Н-А. Картель, К.К.Цие"»нис, А.А.АгрэновсвнЗ.

б. Методы исследования димеров тимина in vivo в ДОС бактерий

И растений. - I-l«tuvs>» genetlk^ ir »•lakclntnlot r*»p. koní. 1 txi».

ki, 1973, 0,2-3. Авт.; К.К.Циеминио, В.Н.Сойфер, И.Ю.Славвч нас, А.Аграновский. - На литоэ-на;

7* Вырезание докеров юшина из ДНК проростков ь&1Ну-

:ти «лИул!,, ОбЛуЧвННЫХ у 71ЪТрафЙОЛв1'07>ЫМ СВОТОМ. -Ы«-

/ог звпвИкч ¡г г л1«ксЕптк1| гее р. коп!. (ехАв . К. ,1973, р.3-5. Авт.: В.Н.Сойфер, К.К.Циеминнс. - На литов.яв.

8. Вкличение Н®- и С1^ тишина и тимидина в ДНК на ранних стадиях развития растений и получение высокомеченой ДИК

"растений. - "физиои-эгия растений", 1974, т.21, й 5, с.946-951. Авт.: В.Н.Сойфер, К.Г.К.Циеминис, Ю.В.Титов.

9. Дшеризация тимина ультрафиолетовым светом в ДНК раоти-телуных клеток и вырезание динаров иа ДНК. в темдоте. Структура ^ функции нуклеиновых кислот. Материалы симпозиума, посвященного памяти А.Н.Ьзло-арского. 11., 1974,

с.¿07. Авт.:В.Н.Сойфер, К К.:1ившвис.

Ю. Темновая репарация в высаях растениях. "Докл.АН СССР", 15'.'4, т.215, Й 5, с, 1261-126^. Авт.: В.Н.Сойфер, К.К. Циеминис.

а >

+ V

Цатериалы диссертации были доложены ня:

I* Республиканских научных нон£эрекциях генетиков к селекционеров Литры, Каунас, 1972, 1973^

2* 2-ом всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы ге- * певческих процессов! гутэгенеэ и репарация", Москва, 1973 (тезиса, г-тр.88-89). . (

% В ей всесоюзной конференции "Проблемы ф ото эн арг ежических ------.:роцес л ра^тени-". Алма-Ата, 1974 (теаисы, стр.183134/.

. 4. 2-йм всесоюзном совещании ВАСХНШ по молекулярное био" л огни, Одессе; 1974.

Тчгрдфмм Х.АСУЧИЛ

- 1«-» Хщм^ОО,